Durante la producción de embriones in vitro, una gran proporción(70-80%) detiene su ciclo celular durante un período determinadopara cada especie coincidiendo con la activación del genomaembrionario, lo cual en bovinos ocurre en el paso de 8 a 16 células(1). Con el ánimo de aportar al estudio de este fenómeno, se determinaron la cinética de producción de H2O2y la función mitocondrial, aspectos relacionados con el mismo (2), en embriones bovinos producidos in vitro (EBPIV) con alto y bajo potencial de desarrollo.

Introducción: La enfermedad de Alzheimer (EA) es una entidad neurodegenerativa y es la causa más común de demencia. Recientemente se reportó en Antioquia (Colombia) un grupo familiar con una mutación puntual en el codon 280 de la Presenilina 1 denominada E280A (sustitución de un ácido glutámico por una alanina), la cual produce un incremento en el acúmulo de b-Amiloide (bA) de 42-43 aminoácidos y una patología cerebral severa. Durante los últimos años se ha propuesto que la muerte celular es uno de los factores principales de pérdida neuronal en la EA. Hasta el presente no se ha establecido el tipo de muerte celular implicadas en la pérdida neuronal. Por lo tanto el objetivo de esta investigación es establecer el tipo de muerte celular que ocurre en la EA y otras demencias tales como la Demencia Fronto Temporal (DFT), Huntington y Demencia Cerebro Vascular, con base en los siguientes criterios: 1. Fragmentación del ADN. 2. Cambios morfológicos nucleares. 3. Cambios citoplasmáticos y 4. Expresión de ciertas proteínas asociadas a muerte celular. Los resultados de esta investigación permitirán establecer una correlación entre los parámetros morfológicos e histoquímicos antes mencionados, entre placas de bA y ovillos neurofibrilares en la EA y con ovillos neurofibrilares en la DFT adicionalmente. Este trabajo nos permitirá determinar si existe un mecanismo común de muerte celular en las enfermedades neurodegenerativas con demencia. Objetivo General: Contribuir a la caracterización de los procesos de muerte celular en cerebros de pacientes con enfermedades neurodegenerativas Objetivos específicos: - Estandarizar un estudio cualitativo in situ para evaluar procesos de muerte celular neuronal en micro-secciones histológicas de las regiones cerebrales frontal, temporal, parietal, hipocampo, occipital y cerebelo de pacientes con la enfermedad de Alzheimer y otras demencias. - Establecer una correlación patológica entre la proporción de núcleos fragmentados y la presencia de placas seniles bA y ovillos neurofibrilares. - Establecer la correlación entre la expresión de las proteínas asociadas a muerte celular como Bax, p53, NF-kB, Par 4 y la fragmentación del ADN. Materiales y Métodos Preparaciones Histológicas: Secciones de tejido de cerebros humanos post-mortem de las regiones seleccionadas provenientes de pacientes con demencia, serán fijadas en formaldehido buferizado y embebidos en bloques de parafina. Secciones de 5mm serán adheridos a láminas precargadas. La deparafinización e hidratación se realizará de acuerdo a procedimientos estandares de histología (Gavrieli et al.,1992). Técnica de marcaje Tunel y Thioflavina: Las secciones serán marcadas in situ para TUNEL (terminal transferasemediated dUTP-fluorecent nick labeling tecnique) de acuerdo al método descrito por Gavrieli et al., 1992 y al protocolo Promega de 1998. Adicionalmente, las láminas serán marcadas con Thioflavina-S para evidenciar las placas seniles bA y ovillos neurofibrilares (Smale et al., 1995). La evaluación semicuantitativa tanto de núcleos Tunel+, como de placas seniles y ovillos se realizarán de acuerdo a Mirra et al. 1991 y Troncoso et al. 1996 respectivamente. Inmunohistoquímica: Las microsecciones del cerebro, se incubarán con los anticuerpos primarios anti-p53, anti-p65(NF-kB), anti-Bax, anti-Par-4. Luego serán incubadas con anticuerpos secundarios anticonejo IgG conjugados con biotina, e incubadas con el sustrato extravidina peroxidasa. La cuantificación se realizará semi cuantitativamente de acuerdo a:(-) no coloración,(+) coloración débil, (++) coloración moderada, (+++) coloración intensa. Adicionalmente, un registro microfotográfico se realizará y los datos se tabularán en tablas.

Introducción: La Enfermedad de Alzheimer, es la demencia más frecuente en la edad adulta y la cuarta causa de muerte en los países desarrollados. Esta demencia, puede presentarse en una forma esporádica, cuando ningún otro familiar ha sido afectado por la enfermedad; o en una forma familiar, cuando en la familia del enfermo ha habido otras personas afectadas por la enfermedad. En Antioquia (Colombia), el grupo de Neurociencias de la Universidad de Antioquia ha detectado el grupo familiar de enfermos de Alzheimer, más grande del mundo; en este grupo se ha determinado como único factor asociado al desarrollo de la enfermedad, la presencia de la mutación de Acido Glutámico por Alanita en el codon 280 de la Presenilina 1. Otra proteína, relacionada con el desarrollo de la Enfermedad de Alzheimer familiar, es la Proteína Precursora de Amiloide, la cual sufre un proceso proteolítico, generando como subproducto un péptido de 39 a 43 amino ácidos llamado b Amiloide, quien es el principal componente de las placas seniles, que constituyen uno de los rasgos histopatológicos de la enfermedad. Con la presente investigación, pretendemos evaluar estas proteínas, en una forma cuantitativa, en células procedentes de: individuos portadores de la mutación E280A enfermos de Alzheimer, portadores de la mutación E280A asintomáticos y sanos no portadores de la mutación. Materiales y Métodos: Cultivos celulares - Detección de la mutación E280A - Western Blotting para las proteínas: Presenilina 1 y la Proteína Precursora de Amiloide - Estudio citogenético de células HeLa - Detección de la Proteína Precursora de Amiloide por Citometría de flujo - Análisis estadístico e interpretación de los resultados Resultados: Por primera vez, se logra la detección de la Proteína Precursora de Amiloide, por medio de Citometría de flujo, lográndose tanto la detección de la proteína en membrana celular como intracelular. Los niveles detectados de la Proteína Precursora de Amiloide en membrana celular, fueron extremadamente bajos, comparados con los encontrados a nivel intracelular. No se encontraron diferencias significativas, en los niveles de expresión de la Proteína Precursora de Amiloide, en ninguno de los tres grupos estudiados (enfermos de Alzheimer portadores de E280A, sanos portadores de E280A y sanos no portadores de la mutación). La expresión de las proteínas: Presenilina 1 y b Amiloide; no fueron detectadas por la técnica de Citometría de flujo.

El depósito del beta-amiloide (βA) en las placas neuríticas esuno de los principales marcadores neuropatológicos de la enfermedad de Alzheimer (EA). Estudios in vitro han demostrado que el fragmento βA25-35, el cual contiene la secuencia funcionalmente citotóxica del péptido amiloide, induce neurotoxicidad y muerte celular por apoptosis (1). A pesar de las intensas investigaciones, no se ha dado una descripción completa de la cascada de eventos moleculares que conducen a muerte inducida por βA25-35 en un modelo celular único. Por lo tanto, nuestro objetivo principal es evidenciar una cascada de eventos moleculares ordenados inducidos por el bA25-35 y el hierro en un modelo celular.

Los embriones producidos in vitro (EPIV) presentan bloqueo en eldesarrollo en el momento de la activación del genoma (8-16 células en bovinos), limitando la producción de blastocitos (35%). Este fenómeno ha sido relacionado con la producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO). Entre las fuentes de ERO se han descrito altas tensiones de oxígeno, exposición a la luz y alteración del metabolismo oxidativo (1). Los EPIV con baja competencia para superar el bloqueo presentan fallas en la funcionalidad mitocondrial (1) y nucleolar, exhibiendo un retardo en su tasa de clivaje (2). Algunos autores han relacionado el tiempo al primer clivaje con la cantidad relativa de ciertostranscriptos, como Glutatión (2), un limpiador de ERO, sugiriendo que los embriones incompetentes presentan fallas  transcripcionales que les impiden defenderse contra las ERO producidas en cultivo, quizás manteniendo niveles elevados de H2O2 lo que los hace más susceptibles al daño celular.Hasta el presente no se ha efectuado un estudio de cinética de producción de ERO, en EPIV bovinos con alta y baja competencia durante el desarrollo temprano, ni se ha logrado esclarecer el papel de la mitocondria en la generación de ERO (como fuente o como blanco).Los objetivos de este estudio son determinar la cinética de producción de H2O2 en embriones con alta y baja competencia para superar el bloqueo y la relación de éstos con procesos de daño mitocondrial y mortalidad embrionaria.