Para la producción masiva de inoculantes basados en bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), es fundamental un medio de cultivo de alto rendimiento. La aplicación secuenciada de diseños estadísticos fue usada para optimizar la producción de biomasa de Azospirillum brasilense C16, seis fuentes nutricionales (glicerol, glutamato, manitol, acido cítrico, extracto de levadura y K2HPO4 3H2O) y tres fuentes minerales (MgSO4 7H2O, FeCl3 y NaCl) fueron evaluadas mediante cinco experimentos estadísticos - Placket-Burman, factorial fraccionado, diseño de paso ascendente, análisis de superficie de respuesta y screening mineral, para tal efecto. La composición optimizada del medio (g L-1) fue: 28,33 glutamato, 2,92 extracto de levadura, 1,34 K2HPO4 3H2O, 0,5 MgSO4 7H2O y 0,02 FeCl3, la cual luego de 24 h de incubación permitió producir una cantidad de proteína (32,04 μg) y biomasa seca (1,51 g L-1) del 1,72 y 1,68 veces más alta, respectivamente, en relación al medio de cultivo convencional.