La mastitis es una enfermedad común en los hatos lecheros, relacionada con pérdidas económicas importantes para el sector. Paralelamente, el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos ha sido una constante preocupación en la medicina humana y veterinaria. Este estudio, se hizo con el fin de identificar los agentes causales de mastitis clínica y subclínica y su estado de resistencia frente a algunos antimicrobianos, en hatos lecheros del municipio de Duitama, Boyacá. Se evaluaron 541 animales en producción, distribuidos en 25 fincas, 12 con ordeño mecánico y 13 con ordeño manual. Se tomaron muestras de leche de los cuartos positivos a mastitis clínica o subclínica para realizarles cultivo bacteriológico y antibiograma. Se encontró que las bacterias Gram positivas son la principal causa de mastitis en la zona, siendo el agente causal de mastitis clínica y subclínica más frecuente, Staphylococcus aureus con porcentajes de 32 y 42%, respectivamente, seguido de otras especies de Staphylococcus. Con menor frecuencia Streptococcus sp. fue el agente causal para ambos tipos de mastitis. En cuanto al estado de resistencia, se observó sensibilidad relativa a la oxacilina, tetraciclina y estreptomicina por parte de agentes Gram positivos. Los resultados obtenidos en este estudio ratifican la importancia de conocer las características de la mastitis en cada zona, con el fin de establecer correctamente los tratamientos respectivos.