Rhipicephalus microplus es la garrapata más prevalente, responsable de transmitir hemoparásitos en ganado bovino de áreas tropicales y subtropicales. Polimorfismos en su genoma confieren resistencia a los acaricidas usados para su control. Una mutación en el gen Est9 que codifica una carboxilesterasa en R. microplus, confiere resistencia a compuestos organofosforados. Este estudio identificó una mutación en garrapatas de campo, colectadas en un predio con historial de resistencia hacia acaricidas organofosforados mediante el uso de PCR – RFLP. Las garrapatas fueron sometidas a un compuesto organofosforado comercial del 83% de concentración, en una prueba de inmersión de teleoginas y el ADN de garrapatas fenotípicamente susceptibles, resistentes y medianamente resistentes fue extraído y usado en la amplificación de un fragmento de 372 pb del gen Est9, mediante el uso de cebadores específicos. Los productos de PCR fueron digeridos con la edonucleasa EcoRI, registrándose el patrón de bandas en los genotipos homocigoto natural, homocigoto mutante y heterocigoto. La prueba exacta de Fisher arrojó diferencias altamente significativas (p=0.0022) entre teleoginas susceptibles y aquellas con algún nivel de resistencia, mostrando relación directa entre fenotipo y genotipo. Así, se comprobó por primera vez en Colombia la presencia de una mutación en el gen Est9 de garrapatas R. microplus resistentes a organofosforados.