Antecedentes: La leptospirosis es la mayor causal de pérdidas reproductivas debidas a abortos, muerte embrionaria temprana e infertilidad. Se desconocen los serovares de Leptospira que actualmente se encuentran circulando en el rebaño colombiano debido a la falta de reportes nacionales. Objetivo: Se investigó la prevalencia de anticuerpos específicos para 13 serovares de Leptospira spp en vacas no vacunadas de 26 rebaños en la región lechera de San Pedro de los Milagros (Provincia de Antioquia). Métodos: La prueba de aglutinación microscópica fue empleada en muestras de suero de acuerdo a las recomendaciones de la OMS. Resultados: Un total de 112/900 (12,4%) de los animales presentaron títulos de anticuerpos de 1:100 o superiores para al menos un serovar de Leptospira. Entre los positivos, el 34/900 (3,8%) de los animals presentaron seroconversión para dos o más serovares. En orden decreciente de prevalencia, los serovares detectados fueron: hardjo prajitno, pomona, grippotyphosa, tarassovi, copenhageni, canicola, cellodeni y Bratislava. En total, 28 animales fueron seropositivos al serovar hardjo. Conclusión: La leptospirosis debería ser incluida como diagnóstico diferencial en problemas reproductivos en esta región.