Helicobacter pylori es un microorganismo que se estima infecta entre el 50 y 70% de la población general en países en vía de desarrollo y su infección se asocia a factores biopsicosociales. Actualmente se conoce la relación patogénica de la bacteria con gastritis, ulcera péptica e incluso cáncer gástrico y respecto a esta última patología, la OMS en 1994 la declaró como agente carcinogénico tipo I. En Colombia existen pocas colecciones caracterizadas microbiológica y clínicamente de éste microorganismo. El presente trabajo determinó las condiciones microbiológicas para el establecimiento de un cepario de H. pylori. Se elaboró un protocolo de laboratorio a partir del acompañamiento de 80 endoscopias de vías digestivas altas luego de aplicar los criterios de selección y solicitar consentimiento informado; se tomaron biopsias a 30 pacientes, las cuales se cultivaron mediante pruebas microbiológicas. La frecuencia de diagnóstico endoscópico fue de 22 casos de gastritis, un caso de ulcera péptica, tres casos de cáncer gástrico y cuatro personas asintomáticas. 20 muestras fueron compatibles con H. pylori. Se seleccionaron cinco cepas, a las cuales se les realizó cinética de crecimiento y fueron evaluadas con diferentes pruebas bioquímicas. Se determinó que las condiciones microbiológicas utilizadas en el protocolo son idóneas para el óptimo aislamiento de H. pylori.